Dag 4

Dag 4

Sista laborationsdagen är här! Våra membran har nu fått hybridisera en hel natt och idag ska vi få se vad resultatet blev.

Dagens moment var:

Stingenstvätt.

Görs för att tvätta bort ospecifikt bundna prober.

 Falkonröret med membran och 20ml 2xSSC, 0,1% SDS rullas över bordet som en manuell tvättmaskin. 2 x 15 min.

Detektion.

Och nu det vi alla har väntat på. Dags att synliggöra resultatet. Membranet kommer att få reagera med lite antikroppar som har ett Fab fragment. Detta kommer få reagera med NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium salt och 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) och kommer då att färgas.

Så här ser det färgade resultatet ut.

Om vi jämför dem sida vid sida så ser vi att proben har hittat LL37-sekvenser i den oklyvda plasmiden, den klyvda (0,5µg) och i PCR-produkten. Annat vore konstigt eftersom de alla tre ursprungligen kommer från samma plasmid. 

 

Den oklyvda plasmiden längst till vänster i bilderna har flera infärgade band vilket beror på att gensekvensen fortfarande sitter i vektorn och den kan ha skadats under den alkaliska lyseringen dag 1. I vanliga fall är den i supercoilform men den kan ha fått en nick i den ena dubbelsträngen och blivit mer cirkulär eller om den gått av i båda strängarna blivit linjär. Dom vandrar då olika långt i gelen och det blir flera olika band. Supercoilformen brukar vandra längst.

Det klyvda provet på 0,5µg som är infärgat i mitten har två band varav det nedersta är mest infärgat. Det är det nedersta bandet (som syns bäst i den högra bilden) som är den helt klyvda LL37-genen. Det övre bandet som syns bäst i elektroforesbilden till vänster är delvis klyvda gensekvenser och vektorer. Eftersom vektorerna är längre än själva gensekvensen binder de till sig mer GelRedfärg och syns därför bäst på den vänstra bilden medans LL37 bara kan anas. 

PCR-produkten som är bandet längst till höger är väldigt tjockt. Det beror på att det är väldigt höga koncentrationer av LL37.

Lärarfrågor:

-Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

PCR: en är väldigt snabb och enkel metod för att hitta en viss gen. Den ger också ett väldigt tydligt svar eftersom den kopierar upp den eftersökta sekvensen i miljarder kopior. Det gäller dock att man är noggrann och inte kontaminerar provet vilket är lätt hänt. Men det gäller också att man vet hur genen man letar efter ser ut och vilken storlek den har. 

Southern blot är en känsligare metod som ger ett starkare utslag på små koncentrationer. Vilket syns i bilderna ovan om man tittar på den klyvda plasmiden. LL37 syns knappt gelelektroforesbilden till vänster medans den syns tydligt i den högra bilden. Den här metoden tar däremot längre tid och är lite bökigare.

-Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Det viktigaste har varit att få planera de olika momenten själva. När vi ska göra vad, material, raster mm. Bra att få en chans att bli lite mer självständig på labb.

Dag 3

Dag 3

Den här dagens moment var:

Elektrofores av klyvt material och Southern blot. Det görs för att separera vektor och insert (den klonade gensekvensen vi letar efter) för att senare kunna identifiera dem. då dag tvås elektrofores misslyckades tog vi även med PCR-produkten i den här gelelektroforesen. Tyvärr tänkte vi inte på att det kunde varit bra att även köra den positiva och negativa kontrollen. Vi tänkte inte heller på hur vi laddade gelen i foreskärlet men vi vaknade till innan vi sabbade försöket som tur var. Måndagsknas helt enkelt.

Felvänt foreskärl.. Negativa DNA-molekyler ska vandra genom gelen mot pluspolen (röd) men vi har satt pluspolen bakom gelen. Smart! >.<

 Enklaste nödlösningen som finns. Ibland är jag smart.

Från vänster: 1) Oklyvd plasmid, 2) Markör III, 3) Klyvd plasmid 0,5µg, 4) Klyvd plasmid 0,005µg*, 5)markör IX, 6) PCR-produkt.

*Ska vara 0,005µg men är bara 0,0025µg pga fel i beräkningen.

Bilden ovan visar resultatet från gelelektroforesen. Till höger ser man en stor markör från PCR-produkten vilket är den amplifierade LL37-genen. Kraftig markör = Hög koncentration. Den tredje raden från vänster med klyvd plasmid (0,5µg) visar en liten tunn liten markör lite ovanför PCR-markören. Det är en lite kortare sekvens av LL37 då restriktionsenzymet klyver lite innanför genens ändar.

När detta var gjort användes gelen till southern blot. Vilket är en högst avancerad metod som kräver väldigt avancerad och dyr utrustning.

 Taadaa! Southern blotting.  Består av en hög pappershanddukar, tre watmanpapper (varav två är doppade i 10xSSC), nylonmembran (även det doppat i vatten och 10xSSC), agarosgelen som fortfarande är snyggt blå. Över detta berg har vi laggt plastfolie, en glasskiva och en flaska med vatten i som bara agerar vikt.

Detta göra för att flytta över DNAt från gelen till ett litet nylonmembran (ser ut som ett plastigt pappersark). Ni märker vad det är bra för. 

Fixering av DNA till membran med UV-strålning. Binder DNAt till membranet så att det inte lossnar när vi tvättar det. (Viktigt om man ska proba DNAt flera gånger.)

Inmärkning av LL-37-gen med DIG-dUTP.

Detta går ut på att vi tar ett LL37-templat som vi märker in med DIG-dUTP som fungerar som en probe. Detta får sedan reagera med gensekvenserna på nylonmembranet.

Prehybridisering. 

Förbereder DNAt på membranet inför tillsatts av probe (inmärkt DNA-templat).

Hybridisering.

Tillsats av proben som får binda till LL37-genen som förhoppningsvis finns på membranet. Detta kommer att få ske över natten så fortsättning kommer dag 4. =)

I röret högst upp ligger våra falkonrör med membran och hybridiseringsvätska. Där får de ligga och snurra hela natten.