Dag 3

Dag 3

Den här dagens moment var:

Elektrofores av klyvt material och Southern blot. Det görs för att separera vektor och insert (den klonade gensekvensen vi letar efter) för att senare kunna identifiera dem. då dag tvås elektrofores misslyckades tog vi även med PCR-produkten i den här gelelektroforesen. Tyvärr tänkte vi inte på att det kunde varit bra att även köra den positiva och negativa kontrollen. Vi tänkte inte heller på hur vi laddade gelen i foreskärlet men vi vaknade till innan vi sabbade försöket som tur var. Måndagsknas helt enkelt.

Felvänt foreskärl.. Negativa DNA-molekyler ska vandra genom gelen mot pluspolen (röd) men vi har satt pluspolen bakom gelen. Smart! >.<

 Enklaste nödlösningen som finns. Ibland är jag smart.

Från vänster: 1) Oklyvd plasmid, 2) Markör III, 3) Klyvd plasmid 0,5µg, 4) Klyvd plasmid 0,005µg*, 5)markör IX, 6) PCR-produkt.

*Ska vara 0,005µg men är bara 0,0025µg pga fel i beräkningen.

Bilden ovan visar resultatet från gelelektroforesen. Till höger ser man en stor markör från PCR-produkten vilket är den amplifierade LL37-genen. Kraftig markör = Hög koncentration. Den tredje raden från vänster med klyvd plasmid (0,5µg) visar en liten tunn liten markör lite ovanför PCR-markören. Det är en lite kortare sekvens av LL37 då restriktionsenzymet klyver lite innanför genens ändar.

När detta var gjort användes gelen till southern blot. Vilket är en högst avancerad metod som kräver väldigt avancerad och dyr utrustning.

 Taadaa! Southern blotting.  Består av en hög pappershanddukar, tre watmanpapper (varav två är doppade i 10xSSC), nylonmembran (även det doppat i vatten och 10xSSC), agarosgelen som fortfarande är snyggt blå. Över detta berg har vi laggt plastfolie, en glasskiva och en flaska med vatten i som bara agerar vikt.

Detta göra för att flytta över DNAt från gelen till ett litet nylonmembran (ser ut som ett plastigt pappersark). Ni märker vad det är bra för. 

Fixering av DNA till membran med UV-strålning. Binder DNAt till membranet så att det inte lossnar när vi tvättar det. (Viktigt om man ska proba DNAt flera gånger.)

Inmärkning av LL-37-gen med DIG-dUTP.

Detta går ut på att vi tar ett LL37-templat som vi märker in med DIG-dUTP som fungerar som en probe. Detta får sedan reagera med gensekvenserna på nylonmembranet.

Prehybridisering. 

Förbereder DNAt på membranet inför tillsatts av probe (inmärkt DNA-templat).

Hybridisering.

Tillsats av proben som får binda till LL37-genen som förhoppningsvis finns på membranet. Detta kommer att få ske över natten så fortsättning kommer dag 4. =)

I röret högst upp ligger våra falkonrör med membran och hybridiseringsvätska. Där får de ligga och snurra hela natten.